Page 184 - Acrobat J Trad-21-3-2566

J Thai Trad Alt Med Vol. 21 No. 3 Sep-Dec 2023 667

2.6 การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างไนตริก- ค่ายับยั้งการสร้างไนตริกออกไซด์และค่าความเข้มข้น
ออกไซด์ ของตัวอย่างที่สามารถยับยั้ง NO ที่ 50% (IC 50) โดยใช้

2.6.1 การเลี้ยงเซลล์ ATDC-5 L-Nitroarginine (L-NA) เป็นสารมาตรฐาน
เซลล์ ATDC-5 ถูกน�ามาเพาะเลี้ยง 2.7 การทดสอบความเป็นพิษ
เซลล์ใน culture flask ที่มีอาหารเลี้ยงชนิด DMEM/ การทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ ATDC-

Ham’s F-12 ที่มีการเติม 5% Fetal Bovine Serum, 5 Mouse Chondrogenic Cell โดยใช้วิธี 3-(4,5-Di-
-8
Human Transferrin 3 ´ 10 M, Penicillin 50 methyl thiazole-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium
unit/ml และ Streptomycin 50 µg/ml, 10 µg/ml Bromide (MTT) Assay ซึ่งหลักการศึกษาจะอาศัย

-8
Human Transferrin, 3 ´ 10 Sodium Selenite เอนไซม์ภายในไมโทคอนเดรีย (mitochondria)
น�าไปบ่มใน CO 2 Incubator ที่มี 5% CO 2 โดยบ่มที่ ของเซลล์ที่มีชีวิตรีดิวส์ MTT ที่เป็นสารสีเหลืองให้
อุณหภูมิ 37˚ซ และ Sub-culture ทุก 2 วัน รอจนได้ เป็นผลึก formazan สีม่วง ท�าการทดสอบโดยเลี้ยง

ปริมาณเซลล์หนาแน่นเต็มที่จึงน�ามาท�าการทดสอบ เซลล์ใน 96 well plate โดยแต่ละหลุมให้มีปริมาณ
2.6.2 การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้าง เซลล์อยู่ที่ 8,000 เซลล์ บ่มในตู้บ่มเป็นเวลา 6 ชั่วโมง

ไนตริกออกไซด์ เพื่อให้เซลล์เกาะ หลังจากนั้นเปลี่ยนอาหารเลี้ยงเป็น
น�าเซลล์ ATDC-5 ไปเลี้ยงในใน 24 well ชนิดที่ไม่มี FBS ยกเว้นในกลุ่มที่เป็นกลุ่มควบคุม
plate โดยให้มีจ�านวนเซลล์ 80,000 cells/well ใน น�าไปบ่มต่อ 24 ชั่วโมง แล้วดูดอาหารเลี้ยงเซลล์

อาหาร DMEM/Ham’s F-12 แล้วบ่มเซลล์ในตู้ CO 2 เก่าออก เติมสารสกัดสมุนไพรที่ความเข้มข้นต่าง ๆ
Incubator ที่มีปริมาณ CO 2 อยู่ 5% อุณหภูมิ 37˚ซ จ�านวน 100 ไมโครลิตร หลังจากทดสอบสารตัวอย่าง

เป็นเวลา 6 ชั่วโมง ดูดอาหารเก่าออกเปลี่ยนเป็นอาหาร กับเซลล์ในตู้ CO 2 incubator ที่มีปริมาณ CO 2 อยู่
ที่ไม่มี FBS จ�านวน 500 ไมโครลิตร ยกเว้นกลุ่ม FBS 5% อุณหภูมิ 37˚ซ เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นเติม
control บ่มต่อเป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้นท�าการ สารละลาย MTT (10 ไมโครลิตร, 5 mg/ml) ลงไปใน

เติมสารสกัดที่ความเข้มข้น 3.125, 6.25, 12.5, 25, แต่ละหลุมแล้วบ่มต่อใน CO 2 incubator ที่มีปริมาณ
50 และ 100 µg/ml ที่ท�าการเจือจางด้วยอาหารเลี้ยง CO 2 อยู่ 5% ที่อุณหภูมิ 37˚ซ เป็นเวลา 4 ชั่วโมง จาก
ที่ไม่มี FBS ลงไป 500 ไมโครลิตร น�าไปบ่มในตู้บ่ม นั้นดูดสารละลายทิ้งไปแล้วเติมตัวท�าละลายผลึก 100

4 ชั่วโมง แล้วเติม LPS ที่ความเข้มข้น 250 ng/ml ไมโครลิตร (เตรียมจาก 10 g SDS+83.7 ไมโครลิตร
บ่มต่อเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นดูดสารละลาย ของ HCl ปรับปริมาตรเป็น 100 ไมโครลิตร ด้วยน�้า
แต่ละหลุมมา 100 ไมโครลิตร ใส่ใน 96 well plate กลั่น) เพื่อละลายผลึก formazan แล้วน�าไปวัดการดูด

แล้วเติม Griess Reagent ลงในแต่ละหลุมอีก 100 กลืนแสงที่ความยาวคลื่น 550 nm ด้วย microplate
ไมโครลิตร จากนั้นจะเกิดปฏิกิริยา Griess Reac- reader โดยสารที่ทดสอบจะถือว่ามีความเป็นพิษต่อ

tion ตรวจวัดปริมาณไนตริกออกไซด์ที่เซลล์สร้าง เซลล์เมื่อค่าร้อยละการรอดชีวิตน้อยกว่า 80% เมื่อ
ขึ้นที่ความยาวคลื่น 550 nm น�าค่าที่ได้ไปค�านวณหา เทียบกับกลุ่มควบคุม