Page 89 - วารสารการแพทย์แผนไทย ปีที่ 20 ฉบับที่ 3 กันยายน-ธันวาคม 2565

J Thai Trad Alt Med Vol. 20 No. 3 Sep-Dec 2022 503

8
DPPH radical scavenging assay 3 5 10 โมลาร, penicillin 50 ยูนิตตอมิลลิลิตร และ
2.4.1 เตรียมสารละลายวิตามินอีความ streptomycin 50 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร human

เขมขน 0-50 mg/ml โดยใชเอทานอล 70% เปนตัว transferrin 10 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และ sodium
-8
ทําละลาย selenite 3 5 10 โมลาร จากนั้นนําไปเก็บไวในตู CO 2
2.4.2 เตรียมสารละลายของสารสกัดความ incubator ที่มีปริมาณ CO 2 อยูที่รอยละ 5 อุณหภูมิ

เขมขน 10 mg/ml โดยใช propylene glycol เปนตัว 37˚ซ. และ subcultured ทุก 2 วัน รอจนไดปริมาณ
ทําละลาย แลวเจือจางใหไดความเขมขน 40, 80, 160, เซลลหนาแนนเต็มที่ เพื่อนําไปใชในการทดสอบฤทธิ์
320 และ 640 mg/ml ดวยเอทานอล 70% ทางชีวภาพของสารสกัด ที่ความเขมขน 3.125, 6.25,

2.4.3 เตรียม positive control โดยใช 12.5, 25, 50 และ 100 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร การ
เอทานอล 70% เปนตัวทําละลาย ทดสอบฤทธิ์ตานการอักเสบโดยยับยั้งการสรางไนตริก-
2.4.4 เตรียมสารละลาย 0.2 mM DPPH ออกไซด ที่ถูกเหนี่ยวนําโดย lipopolysaccharide

โดยใชเอทานอล 95% เปนตัวทําละลาย (LPS) ที่ไดมาจากผนังเซลลของแบคทีเรีย Esche-
2.4.5 ปิเปตสารละลายในขอ 2.4.2 จํานวน richia coli (055: B5) ใหเกิดการสรางไนตริกออกไซด

100 ml และสารละลายในขอ 2.4.4 จํานวน 100 ml ลง โดยมีขั้นตอนการศึกษาโดยยอดังนี้ เลี้ยงเซลลความ
ใน 96 well plate ผสมใหเขากันแลวตั้งในที่มืด ที่ เขมขน 80,000 cells/well ในอาหาร DMEM/Ham’s
อุณหภูมิหองเปนเวลา 30 นาที วัดคาการดูดกลืนแสง F-12 ที่ไมมี FBS 500 มิลลิลิตร ใน 24 well plate

ที่ 517 นาโนเมตร ดวย microplate reader โดยเทียบ แลวบมเซลลในตู CO 2 incubator ที่มีปริมาณ CO 2
กับสารมาตรฐานวิตามินอี แสดงคาเปนการยับยั้งที่ อยูรอยละ 5 อุณหภูมิ 37˚ซ. เปนเวลา 24 ชั่วโมง แลว

[14]
รอยละ 50 (IC 50 value) ทํา 5 ตัวอยาง pretreat เซลลดวยสารสกัดเปนเวลา 4 ชั่วโมง แลว
2.5 การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการสร้างไนตริก- กระตุนดวย 250 นาโนกรัมตอมิลลิลิตร LPS ในอาหาร
ออกไซด์ ปกติปริมาณ 500 ไมโครลิตร ลงในแตละหลุม จาก

ตํารับยาบํารุงไขขอมีอวัยวะเป้าหมายไปออก นั้นเติมตัวอยาง ทดสอบลงไป 500 ไมโครลิตร และ
ฤทธิ์ที่เซลลกระดูกออนที่ขอเขา จึงเลือกใช ATDC-5 บมเซลลในตู CO 2 incubator ที่มีปริมาณ CO 2 อยู
mouse chondrogenic cell ซึ่งเปนเซลลกระดูก รอยละ 5 อุณหภูมิ 37˚ซ. เปนเวลา 24 ชั่วโมง จาก

ออนขอเขาหนู จะถูกเก็บไวที่อุณหภูมิ -80˚ซ. เมื่อนํา นั้นดูดสารละลายแตละหลุมมา 100 ไมโครลิตร ใส
เซลลมาทดสอบจะละลายที่อุณหภูมิ 37˚ซ. จากนั้นนํา ใน 96 well plate แลวเติม griess reagent ลงใน
เซลลไปหมุนเหวี่ยงดวยเครื่อง centrifuge ที่ 1,500 แตละหลุมอีก 100 ไมโครลิตร จากนั้นจะเกิดปฏิกิริยา

rpm เปนเวลา 5 นาที และดูดสารละลายอาหารเลี้ยง griess reaction ตรวจวัดปริมาณไนตริกออกไซด
เซลลที่แยกออกทิ้ง แลวนําไปเลี้ยงใน culture flask ที่เซลลสรางขึ้นที่ความยาวคลื่น 550 นาโนเมตร นํา

โดยเพาะเลี้ยงเซลลในอาหารเลี้ยงชนิด DMEM/ คาที่ไดไปคํานวณหาคายับยั้งการสรางไนตริกออกไซด
Ham’s F-12 ซึ่งในอาหารจะมีสวนประกอบของ และสรางกราฟระหวางคายับยั้งการสรางไนตริก-
รอยละ 5 fetal bovine serum, human transferrin ออกไซดกับความเขมขนของตัวอยาง ที่ความเขมขน