Page 132 - วารสารการแพทย์แผนไทย ปีที่ 21 ฉบับที่ 2

348 วารสารการแพทย์แผนไทยและการแพทย์ ทางเลือก ปีที่ 21 ฉบับที่ 2 พฤษภาคม-สิงหาคม 2566

[12]
ท�าการศึกษาตามวิธีของ Maiuthed et al. โดยเริ่ม NF-kb การศึกษานี้ท�าการศึกษาตามวิธีของ Dold
จากSubculture ด้วย 0.25% Trypsin-EDTA และ et al. โดยเริ่มจาก Subculture ด้วย 0.25%
[13]
นับเซลล์เพื่อน�าไปเพาะเลี้ยง โดยใช้เซลล์แมคโครฟาจ Trypsin-EDTA และนับเซลล์เพื่อน�าไปเพาะเลี้ยง
RAW-Dual จ�านวน 2,000 เซลล์ ลงใน 96-well โดยใช้เม็ดเลือดขาวชนิดแมคโครฟาจ RAW-Dual
plate จากนั้นน�าไปบ่มที่อุณหภูมิที่ 37˚ซ, 5% CO 2 จ�านวน 200,000 เซลล์ต่อหลุม ลงใน 96-well plate

เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นดูดอาหารเลี้ยงเซลล์เดิม และบ่มที่อุณหภูมิ 37˚ซ, 5% CO 2 เป็นเวลา 12 ชั่วโมง
ออกจากหลุมหลังจากนั้นเติมสารสกัดเครื่องแกงเลียง จากนั้นดูดอาหารเลี้ยงเซลล์เดิมออกจากหลุมหลัง
ที่ความเข้มข้น 0, 6.25, 12.5 และ 25 ไมโครกรัมต่อ แล้วเติมสารสกัดเครื่องแกงเลียงที่ความเข้มข้น 0,

มิลลิลิตร ปริมาตร 100 ไมโครลิตร ลงในแต่ละหลุม 6.25, 12.5 และ 25 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาตร
ของ 96-well plate และบ่มที่อุณหภูมิ 37˚ซ, 5% 200 ไมโครลิตร ลงในแต่ละหลุม และบ่มที่อุณหภูมิ
CO2 เป็นเวลา 24, 48, 72 และ 96 ชั่วโมง หลังจาก 37˚ซ, 5% CO 2 เป็นเวลา 18 ชั่วโมง ในกรณีที่ต้องการ

ครบ 24, 48, 72 และ 96 ชั่วโมง ดูดสารสกัดเครื่อง ทดสอบผลการตอบสนองของเซลล์แมคโครฟาจต่อ
แกงเลียงออกจากหลุมของ 96-well plate แล้วเติม triacylated N-terminal part ของไลโปโปรตีนของ

สารละลาย 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- แบคทีเรียจะท�าการเติมสาร Pam3Cys-Ser-(Lys)4,
Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) ใน 1X hydrochloride ที่ความเข้มข้นสุดท้ายเท่ากับ 1
Phosphate Buffered Saline (PBS) (ที่ความเข้มข้น ไมโครกรัมต่อ 200 ไมโครลิตรเป็นระยะเวลา 6 ชั่วโมง

0.5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร) ปริมาตร 100 ไมโครลิตร เตรียมสาร QUANTI-Blue Solution ลงใน 96-
ต่อหลุม และบ่มที่อุณหภูมิ 37˚ซ, 5% CO 2 เป็นเวลา well plate ปริมาตร 180 ไมโครลิตร เมื่อครบ 24

3 ชั่วโมง ดูดสารละลาย 3-(4,5-Dimethylthiazol- ชั่วโมงแล้วดูดส่วนใสด้านบน (supernatant) ลงใน
2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) สาร QUANTI-Blue Solution 20 ไมโครลิตร บ่มที่
ออก และละลายผลึก Formazan ด้วย Dimethyl อุณหภูมิ 37˚ซ, 5% CO 2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง น�าไปวัด

Sulfoxide (DMSO) ปริมาตร 100 ไมโครลิตรต่อ ค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 620 นาโนเมตร
หลุม แล้วน�าไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น และค�านวณ %SEAP ตามสมการ
570 นาโนเมตร และค�านวณ %Cell Viability ตาม %SEAP = (OD 620 Sample/ OD 620 Control)
[12]
สมการ 5 100
%Cell Viability = (OD570 Sample/ OD570
Control) 5 100 ผลก�รศึกษ�

2.5 การทดสอบผลของสารสกัดเครื่องแกง 1. ผลการสกัดเครื่องแกงเลียง
เลียงต่อการแสดงออกของการท�างานของวิถีชีว สารสกัดเครื่องแกงเลียงที่ได้มีลักษณะ

โมเลกุล NF-kb คล้ายคลึงกันในการสกัดทั้ง 3 ระยะเวลาของการ
ในการทดสอบผลของสารสกัดเครื่องแกงเลียง สกัด กล่าวคือ มีลักษณะเป็นผงหยาบ เกาะตัวกันเป็น
ต่อการแสดงออกของการท�างานของวิถีชีวโมเลกุล แผ่น มีน�้าหนักเบาและฟู แต่จะมีความแตกต่างกัน