Page 131 - วารสารการแพทย์แผนไทย ปีที่ 21 ฉบับที่ 2

J Thai Trad Alt Med Vol. 21 No. 2 May-Aug 2023 347

Medium (DMEM) High glucose ที่ประกอบด้วย 10,000 เซลล์, เซลล์เยื่อบุทางเดินอาหาร (HT-29
10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% GlutaMAX, cell line) จ�านวน 10,000 เซลล์, เซลล์เยื่อบุหลอด

1% Penicilin Streptomycin และ 1% HEPES เลือด (EA.hy926 cell line) จ�านวน 10,000 เซลล์
Buffer Solution ปริมาตร 15 มิลลิลิตร เปลี่ยนอาหาร และ เซลล์แมคโครฟาจ (RAW-Dual™ (IRF-Lucia/
เลี้ยงเซลล์ทุก 1-2 วัน จากนั้นน�าไป Subculture โดย KI-[MIP-2]SEAP) cell line) จ�านวน 5,000 เซลล์

- ดูดอาหารเลี้ยงเซลล์ออก หลังจากนั้นล้าง ลงใน 96-well plate จากนั้นน�าไปบ่มที่อุณหภูมิที่
Fetal Bovine Serum (FBS) ที่อยู่ในอาหารเลี้ยงเซลล์ 37˚ซ, 5% CO 2 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นดูดอาหาร
ด้วย 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) เพื่อให้ เลี้ยงเซลล์เดิมออกจากหลุมหลังจากนั้นเติมสารสกัด

ขั้น Trypsinization ท�างานได้ดียิ่งขึ้น เครื่องแกงเลียงที่ความเข้มข้น 0, 6.25, 12.5, 25,
- Trypsinization ด้วย 0.25% Trypsin- 50 และ 100 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ปริมาตร 100
EDTA ปริมาตร 3 มิลลิลิตร โดยกลั้วให้ทั่วทั้ง Flask ไมโครลิตร ลงในแต่ละหลุมของ 96-well plate และ

หลังจากนั้นดูด 0.25% Trypsin-EDTA ออก บ่มที่อุณหภูมิ 37˚ซ, 5% CO2 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง
- น�าไปบ่มที่อุณหภูมิที่ 37˚ซ, 5% CO 2 หลังจากครบ 24, 48, 72 และ 96 ชั่วโมง ดูดสารสกัด

เป็นเวลา 12 นาที เครื่องแกงเลียงออกจากหลุมของ 96-well plate แล้ว
- เติมอาหารเลี้ยงเซลล์ ปริมาตร 6 เติมสารละลาย 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
มิลลิลิตร เพื่อหยุดการท�างานของ 0.25% Trypsin- Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) ใน1X

EDTA แล้ว Suspension เซลล์จนเซลล์กระจาย Phosphate Buffered Saline (PBS) (ที่ความเข้มข้น
ออกจากกัน หลังจากนั้นดูดอาหารเลี้ยงเซลล์ออก 5 0.5 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร) ปริมาตร 100 ไมโครลิตร

มิลลิลิตร และเติมอาหารเลี้ยงเซลล์ใหม่ปริมาตร 14 ต่อหลุม และบ่มที่อุณหภูมิ 37˚ซ, 5% CO 2 เป็นเวลา
มิลลิลิตร 3 ชั่วโมง ดูดสารละลาย 3-(4,5-Dimethylthiazol-
- Label Passage เซลล์และน�าไปบ่ม 2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT)

ที่ HERACELL VIOS 160i (CO 2 Incubator) ที่ ออก และละลายผลึก Formazan ด้วย Dimethyl

อุณหภูมิที่ 37˚ซ, 5% CO 2 Sulfoxide (DMSO) ปริมาตร 100 ไมโครลิตรต่อหลุม
2.3 การทดสอบความเป็นพิษของสารสกัดใน น�าไปวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 570 นาโน

เซลล์เพาะเลี้ยง เมตร ค�านวณ %Cell Viability ตามสมการ
[12]
ในการทดสอบความเป็นพิษของสารสกัดใน %Cell Viability = (OD570 Sample/ OD570
เซลล์เพาะเลี้ยง ผู้วิจัยท�าการศึกษา Cell Viability Control) 5 100

[12]
ตามวิธีของ Maiuthed et al. โดยเริ่มจากท�าการ 2.4 การทดสอบผลของสารสกัดเครื่องแกง
Subculture เซลล์เพาะเลี้ยงด้วย 0.25% Trypsin- เลียงต่อการเจริญเติบโตของเซลล์แมคโครฟาจ

EDTA และนับเซลล์เพื่อน�าไปเพาะเลี้ยง โดยใช้เซลล์ ในการทดสอบผลของสารสกัดเครื่องแกงเลียง
เยื่อบุทางเดินหายใจ (Beas-2B cell line) จ�านวน ต่อการเจริญเติบโตของเซลล์แมคโครฟาจ การศึกษา