Page 67 - วารสารปีที่17ฉบับที่1

J Thai Trad Alt Med Vol. 17 No. 1 Jan-Apr 2019 57

ก�รเตรียมพืชและส�รสกัดมะห�ด ppm โดยละลายด้วย dimethyl sulfoxide (DMSO)

งานวิจัยนี้ใช้แก่นมะหาดจากบริษัทสมุนไพร จากนั้นหยดสารสกัดมะหาดลงบนกระดาษทรงกลม
ท่าพระจันทร์ จำากัด โดยแก่นมะหาดถูกนำามาล้าง โดยให้แต่ละจุดมีปริมาตร 10 ไมโครลิตร นำาไปบ่มที่
ทำาความสะอาด อบแห้งและบดให้ละเอียด หลังจาก อุณหภูมิ 37˚C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ทำาการวัดเส้นผ่าน

นั้นทำาการเตรียมสารสกัดมะหาด 3 แบบ โดยการสกัด ศูนย์กลางโซนการยับยั้งที่เกิดขึ้นด้วยเวอร์เนียคาลิป
แก่นมะหาดด้วยตัวทำาละลายที่แตกต่างกัน 3 ชนิด คือ เปอร์ (vernier calipers) สำาหรับชุดควบคุมเชิงบวก
นำ้ากลั่น เอทานอล 95% และ เฮกเซน ในอัตราส่วน 1:4 และลบใช้ ยาปฏิชีวนะ amoxicillin (30 ไมโครกรัม/

นำาไปเขย่าที่ความเร็วรอบ 125 รอบต่อนาที เป็นเวลา disc) และ DMSO ตามลำาดับ โดยทำาการทดสอบเป็น
24 ชั่วโมง โดยทำาการสกัดแก่นมะหาดด้วยตัวทำา จำานวน 5 ซำ้า
ละลายแต่ละชนิดจำานวน 3 ซำ้า หลังจากนั้นกรองสาร ก�รทดสอบห�คว�มเข้มข้นตำ่�ที่สุด

สกัดมะหาดที่ได้ด้วยผ้าขาวบางและทำาการระเหยตัว
ทำาละลายที่ใช้สกัดด้วยเครื่อง rotary evaporator การหาค่าความเข้มข้นตำ่าที่สุดที่สามารถยับยั้ง

บันทึกลักษณะทางกายภาพของสารสกัดที่ได้และ การเจริญของเชื้อแบคทีเรีย (Minimum Inhibitory
คำานวณร้อยละของสารที่สกัดได้ [ร้อยละของสารสกัด Concentration; MIC) และความเข้มข้นตำ่าที่สุดที่
= (นำ้าหนักของสารสกัด/นำ้าหนักแห้งของตัวอย่าง) x สามารถทำาลายเชื้อแบคทีเรีย (Minimum Bacteri-

100] เก็บสารสกัดมะหาดที่ได้ในขวดสีชาที่อุณหภูมิ cidal Concentration; MBC) ของสารสกัดมะหาดที่
4˚C เพื่อใช้ในการทดสอบฤทธิ์ในการยับยั้งแบคทีเรีย สกัดด้วยตัวทำาละลายทั้ง 3 ชนิด ทำาโดยใช้วิธี broth

ของสารสกัดมะหาดต่อไป dilution assay คือ เตรียมสารสกัดมะหาดด้วยการ
เจือจางครั้งละ 2 เท่า (two-fold dilution) ให้ได้สาร
ก�รทดสอบฤทธิ์ยับยั้งก�รเจริญของเชื้อ สกัดมะหาดเข้มข้นในช่วง 781-25,000 ppm หลังจาก

แบคทีเรีย นั้นเตรียมเชื้อแบคทีเรียทดสอบให้มีจำานวนเซลล์

8
ทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของเชื้อแบคทีเรีย เท่ากับ 10 CFU/ml เติมเชื้อลงในหลอดทดลองหลอด
ก่อโรคของสารสกัดมะหาดที่สกัดด้วยตัวทำาละลาย ละ 100 ไมโครลิตร ผสมเชื้อทดสอบและสารสกัด

ชนิด โดยวิธี agar-disc diffusion (ดัดแปลงจาก มะหาดให้เข้ากัน บ่มที่อุณหภูมิ 37˚C เป็นเวลา 24
[9]
Ratananikom, 2014) เขี่ยเชื้อทดสอบ 1 โคโลนีมา ชั่วโมง จากนั้นให้สังเกตความขุ่นหรือใสของอาหาร
เพาะเลี้ยงในอาหาร nutrient broth (NB) บ่มที่ โดยค่า MIC คือ ความเข้มข้นที่น้อยที่สุดที่สามารถ

อุณหภูมิ 37˚C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ปรับความเข้มข้น ยับยั้งการเจริญของเชื้อได้ โดยเมื่อสังเกตอาหารเลี้ยง
8
ของจำานวนเซลล์เท่ากับ 10 CFU/ml จากนั้นดูดเชื้อ เชื้อจะมีลักษณะใสแสดงถึงไม่มีการเจริญของเชื้อ และ
ทดสอบ 100 ไมโครลิตรมาเกลี่ยให้ทั่วหน้าอาหารแข็ง ทำาการดูดเชื้อในแต่ละหลอดมาเกลี่ยบนอาหารแข็ง

NA ทำาการวางกระดาษวงกลมที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง NA แล้วบ่มที่อุณหภูมิ 37˚C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อ
6 มิลลิเมตร ที่ผ่านการฆ่าเชื้อลงไปบนอาหารแข็ง ดูการเจริญของเชื้อบนอาหารแข็ง NA ต่อไป ในส่วน
เตรียมสารสกัดมะหาดให้มีความเข้มข้น 500,000 ของค่า MBC คือ ความเข้มข้นตำ่าสุดที่สามารถทำาลาย