Page 99 - วารสารการแพทย์แผนไทย ปีที่ 20 ฉบับที่ 3 กันยายน-ธันวาคม 2565

J Thai Trad Alt Med Vol. 20 No. 3 Sep-Dec 2022 513

ข้าวเย็นใต้และหนอนตายหยากจากจังหวัดเพชรบูรณ์ 2.2 การทดสอบฤทธิ์ความเป็นพิษต่อเซลล์
รากนมแมวจากจังหวัดล�าปาง เหง้าพุทธรักษาจาก มะเร็ง

จังหวัดสุพรรณบุรี รวมจ�านวนสมุนไพรทั้งสิ้น 6 เซลล์ที่ใช้ในการทดลองมีจ�านวน 2 ชนิด ได้แก่
ชนิดโดยหัวข้าวเย็นเหนือจะถูกน�าไปตรวจสอบเทียบ เซลล์มะเร็งรังไข่ (SKOV-3) ATCC HTB-77 ซึ่ง
สายพันธุ์และขอเลขอ้างอิงจากพิพิธภัณฑ์พืชสิรินธร จะถูกเพาะเลี้ยงในอาหาร Dulbecco’s Modified

กรมวิชาการเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ เลข Eagle Medium (DMEM) และเซลล์มะเร็งมดลูก
อ้างอิง SKP A062041305 หนอนตายหยาก นมแมว (HEC-1-A) ATCC HTB112 ถูกเพาะเลี้ยงในอาหาร
และพุทธรักษาถูกน�าไปตรวจสอบเทียบสายพันธุ์และ McCoy’s 5a medium โดยอาหารที่เพาะเลี้ยงเซลล์

ขอเลขอ้างอิงจากพิพิธภัณฑ์สมุนไพร กรมการแพทย์ ทั้งสองชนิดจะมีการเติม 10% fetal bovine serum
แผนไทยและการแพทย์ทางเลือกโดยมีเลขอ้างอิงคือ (FBS), 50 IU/mL เพนนิซิลินและ 50 µg/mL
TMM-c No.1000643, TMM No.0006005 และ สเตรปโตมัยซิน เซลล์จะถูกเพาะเลี้ยงในตู้บ่มที่

TMM No.0006006 ตามล�าดับ อุณหภูมิ 37˚ซ. ที่มีความเข้มข้นคาร์บอนไดออกไซด์ 5%
การทดสอบฤทธิ์ความเป็นพิษต่อเซลล์มะเร็ง
2. วิธีกำรศึกษำ จะใช้เทคนิค sulphorhodamine B (SRB) โดย
[17]
2.1 การสกัดสาร ท�าการเพาะเลี้ยงเซลล์ลงในเพลท 96 หลุม โดยใส่
5
น�าสมุนไพรมาล้างท�าความสะอาด หั่นเป็นชิ้น เซลล์ SKOV-3 ที่ความหนาแน่น 1 5 10 เซลล์/หลุม
เล็ก ๆ แล้วน�าไปอบแห้งด้วยตู้อบลมร้อนที่อุณหภูมิ ส�าหรับเซลล์ HEC-1-A ใส่ที่ความหนาแน่น 5 5 10 4
50˚ซ. หลังจากนั้นน�าสมุนไพรชั่งอย่างละเท่า ๆ กัน เซลล์/หลุม ท�าการบ่ม 24 ชั่วโมง จากนั้นท�าการเตรียม

บดผสมเป็นต�ารับ แล้วจึงท�าการสกัดสารจากต�ารับ สารสกัดที่ความเข้มข้น 10 mg/mL โดยที่สารสกัดชั้น
และสมุนไพรเดี่ยวโดยใช้ตัวท�าละลาย 2 ชนิด ได้แก่ เอทานอลจะละลายด้วย dimethylsulphoxide ใน
การน�าสมุนไพรไปแช่สกัดด้วยเอทานอล (95%) เป็น ขณะที่สารสกัดชั้นน�้าจะละลายด้วยน�้า deionized

เวลา 3 วัน หลังจากนั้นท�าการกรอง แล้วน�าของเหลว water แล้วน�าไปกรองผ่านกระดาษกรองขนาด 0.22
ที่ได้ไประเหยตัวท�าละลายออกด้วยเครื่องระเหยแห้ง µm จากนั้นท�าการเจือจางสารสกัดให้มีความเข้ม
แบบสุญญากาศ ท�าซ�้าอีกสองครั้ง แล้วน�าไประเหยตัว ข้นต่าง ๆ กัน โดยเตรียมแบบเจือจางลดลง 2 เท่า

ท�าละลายออกจนแห้ง ส�าหรับวิธีที่สองคือน�าสมุนไพร (serial 2-fold dilution) และใช้อาหารเลี้ยงเซลล์ใน
ไปต้มกับน�้าให้เดือด 15 นาที แล้วกรองเอาแต่น�้า ท�า การเจือจาง แล้วจึงท�าการเติมสารสกัดที่ความเข้มข้น
เช่นนี้ซ�้าอีกสองครั้ง จากนั้นน�าน�้าที่กรองได้ทั้งสามครั้ง ต่าง ๆ ลงไปหลุมละ 100 µL ท�าการบ่มต่ออีก 72

มาต้มเคี่ยวให้เหลือหนึ่งในสามส่วน แล้วน�าไปท�าให้ ชั่วโมง หลังจากนั้นท�าการล้างเซลล์ด้วย phosphate
แห้งด้วยเครื่องท�าแห้งแบบแช่เยือกแข็ง หลังจากนั้น buffer saline ที่ปราศจากเชื้อแล้วเติมอาหารใหม่

น�าสารสกัดที่ได้เก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20˚ซ. จนกว่าจะ ลงไป จากนั้นบ่มต่ออีก 72 ชั่วโมง แล้วท�าการตรึง
น�าไปทดสอบ เซลล์ด้วย 40% trichloroacetic acid บ่มเป็นเวลา
1 ชั่วโมง แล้วย้อมด้วยสี 0.4% SRB บ่ม 30 นาที