Page 100 - วารสารการแพทย์แผนไทย ปีที่ 20 ฉบับที่ 3 กันยายน-ธันวาคม 2565

514 วารสารการแพทย์แผนไทยและการแพทย์ ทางเลือก ปีที่ 20 ฉบับที่ 3 กันยายน-ธันวาคม 2565

จากนั้นล้างเพลทแล้วตั้งทิ้งให้แห้ง ท�าการละลายสี ซึ่งจะท�าการเคลือบเพลทด้วย capture antibody
ด้วย 10 mM Tris base น�าไปวัดค่าการดูดกลืนแสง ที่จ�าเพาะกับโปรตีนที่ต้องการตรวจวัด จากนั้นเติม

ที่ความยาวคลื่น 492 นาโนเมตร แล้วค�านวณหาค่า ตัวอย่างที่ต้องการตรวจวัดลงไป บ่มต่ออีก 2 ชั่วโมง
IC 50 โดยเปรียบเทียบกับยา Paclitaxel (ยามาตรฐาน) จากนั้นล้างเพลท แล้วเติม detection antibody
ที่ท�าการละลายด้วย dimethylsulphoxide ที่ความ และ streptavidin-HRP และในขั้นตอนสุดท้ายเติม

เข้มข้น 1 mg/mL แล้วท�าการเจือจางด้วยอาหารเลี้ยง TMB substrate solution ทิ้งไว้ 20 นาทีที่อุณหภูมิ
เซลล์ให้มีความเข้มข้นต่าง ๆ โดยเตรียมแบบเจือจาง ห้อง ท�าการหยุดปฏิกิริยาด้วย 2N H SO น�าไปวัดค่า
4
2
ลดลง 2 เท่าเช่นกัน การดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตรแล้ว
2.3 การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งการอักเสบ ค�านวณค่า %inhibition หาค่า IC 50 [18-20]
การทดสอบฤทธิ์ต้านการอักเสบจะศึกษาการ 2.4 การทดสอบฤทธิ์ต้านเชื้อรา
ยับยั้ง TNF-α และ IL-6 ในเซลล์แมคโครฟาจของ เชื้อราที่ใช้ในการศึกษาได้แก่ Candida al-

หนู (RAW 264.7) โดยเซลล์จะถูกเพาะเลี้ยงในอาหาร bicans ATCC 9028 โดยเพาะเลี้ยงในอาหาร Sa-
DMEM ที่มีการเติม 10% FBS, 50 IU/mL เพนนิซิลิน bouraud’s dextrose agar (SDA) บ่มที่อุณหภูมิ

และ 50 µg/mL สเตรปโตมัยซิน ท�าการเพาะเลี้ยง 37˚ซ. เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ในการทดสอบจะใช้เทคนิค
[21]
ในตู้บ่มเซลล์ที่อุณหภูมิ 37˚ซ. ที่มีความเข้มข้น Microtitre plate based method โดยเริ่มต้น
คาร์บอนไดออกไซด์ 5% จากนั้นน�าไปทดสอบโดยใส่ จากการเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหารเหลว Muller Hinton

5
เซลล์ลงไปในเพลท 96 หลุมที่ความหนาแน่น 1 5 10 broth (MHB) และปรับความขุ่นให้เท่ากับ 0.5 Mc-
เซลล์/หลุม บ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นดูดอาหาร farland จากนั้นท�าการเตรียมสารสกัดที่ความเข้มข้น

เก่าออก แล้วท�าการกระตุ้นเซลล์ให้เกิดการอักเสบ 500 mg/mL โดยที่สารสกัดชั้นเอทานอลจะละลาย
ด้วยการเติม lipopolysaccharide จากนั้นท�าการ ด้วย dimethylsulphoxide ในขณะที่สารสกัดชั้นน�้า
เตรียมสารสกัดที่ความเข้มข้น 10 mg/mL โดยที่ จะละลายด้วยน�้า deionized water แล้วน�าไปกรอง

สารสกัดชั้นเอทานอลจะละลายด้วย dimethylsul- ผ่านกระดาษกรองขนาด 0.22 µm แล้วจึงท�าการเจือ
phoxide ในขณะที่สารสกัดชั้นน�้าจะละลายด้วย จางให้มีความเข้มข้นต่าง ๆ กัน โดยเตรียมแบบเจือ
น�้า deionized water แล้วน�าไปกรองผ่านกระดาษ จางลดลง 2 เท่า (serial 2-fold dilution) และความ

กรองขนาด 0.22 µm จากนั้นท�าการเจือจางสารสกัด เข้มข้นสูงสุดในการเตรียมเพื่อทดสอบจะมีค่าเท่ากับ
ให้มีความเข้มข้นต่าง ๆ กัน โดยเตรียมแบบเจือจาง 10 mg/mL ท�าการเติมสารสกัดที่ความเข้มข้นต่าง ๆ
ลดลง 2 เท่า (serial 2-fold dilution) และใช้อาหาร กันลงในเพลท 50 µL/หลุม แล้วท�าการเติมเชื้อที่ปรับ

เลี้ยงเซลล์ในการเจือจาง แล้วจึงท�าการเติมสารสกัดที่ ความขุ่นไว้ลงไปที่ปริมาตร 50 µL/หลุม จากนั้นบ่มที่
ความเข้มข้นต่าง ๆ ลงไปหลุมละ 100 µL บ่มต่อเป็น อุณหภูมิ 37˚ซ. เป็นเวลา 48 ชั่วโมง แล้วท�าการเติมสี

เวลา 24 ชั่วโมง เมื่อครบตามเวลาที่ก�าหนดให้ท�าการ resazurin ลงไปในแต่ละหลุม ท�าการบ่มต่อที่อุณหภูมิ
น�าส่วนใสไปตรวจวัดปริมาณ TNF-α และ IL-6 37˚ซ. เป็นเวลา 3 ชั่วโมง แล้วอ่านผลโดยการสังเกต
ด้วยเทคนิค ELISA โดยใช้วิธี Sandwich ELISA การเปลี่ยนสีของ resazurin โดยความเข้มข้นต�่าสุดที่